培养基的杀菌

以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。 **步：准备好配制培养基的一切用具和试剂。 

第二步：称量5 g琼脂和30 g蔗糖，溶解在大约所要配制培养基 2/3~3/4左右体积（约600~750 ml）的（蒸馏）水中，加热溶解，不时搅拌，避免出现琼脂生块和泡沫。 

第三步：根据用量，用量简或移液管从母液中取出所需量的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素（每做1000 ml培养基，取20 ml大量成分、20 ml氯化钙母液、10 ml微量成分、10 ml铁盐母液和10 ml有机成分，以及3.0 mg NAA），放入预先有少量蒸馏水的烧杯中（以免加药液时溅出），然后加入琼脂和糖水溶液中搅拌混匀。 

第四步：加水定容。待搅拌均匀后，用数滴稀碱（NaOH）将pH值调节到预定水平（一般为pH 5.8），当pH值偏碱时用稀酸（HCl）调节。用pH试纸或酸碱指示（或pH）计测定培养基的pH值。 

第五步：将培养基用漏斗分装到培养容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加盖。 第六步：培养基进行灭菌。高压蒸气灭菌锅的温度为121℃，灭菌15~20分钟。 培养基常用高温高压（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸气灭菌的方法，灭菌时间应根据培养瓶体积大小及其内培养基容量多少而定（见表4）。体积和容量越大，所需灭菌时间就越长。空试管、空三角瓶和滤纸要在130℃下灭30分钟或121℃灭60分钟。空的培养容器不应同盛装培养基的培养容器一起高压蒸气灭菌，不同体积培养容器或盛装不同容量的培养基也不能一起高压蒸气灭菌，而应该分别进行。因为热穿透力是一个需要考虑的因素，体积大的培养容器需要较长的时间灭菌，是因为热量穿透大体积培养基要比体积小的花更多的时间。利用高压蒸气灭菌锅进行灭菌具有简单、快速，并且可以附带杀灭病毒又不吸收的优点（与过滤灭茵比较）。其缺点是会引起pH值的变化、发生化学变化和引起某些化合物的分解，使得某些培养基成分的活性丧失。高压蒸气灭菌会引起以下物质分解：蔗糖（分解为葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%会丧失反应活性）维生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性丧失）。所以，原生质体培养用培养基应采用过滤法灭菌。 

表4 培养基或无菌水的**少灭菌时间 

容器分装体积（mL） 121℃下**少灭菌时间（min） 20~60 15 75~150 20 250~500 25 1000以上 30以上 

过滤灭菌可以除去溶液或液体培养基中直径大于过滤膜网孔直径的微粒、微生物和病毒。与高压蒸气灭菌法相比，该法不会改变那些在高压蒸气灭菌中不稳定物质，但是也有些明显的缺点，如复杂而费时。通常采用0.22~0.45μm孔径的醋酸纤维素或硝酸纤维素膜筛。对培养基中的不稳定成分进行过滤灭菌时，shou先对除不稳定成分以外的培养基进行高温高压灭菌，灭菌后放置于超净工作台中冷却，温度降到 40~50℃时，在琼脂培养基尚未固化之前，在无菌条件下用注射器和无菌微孔滤膜（图1.7）将高温不稳定物质溶液打入培养基。  

一一一一、、、、培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术培养基的配制与灭菌技术       培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的用于培养微生物的营养基质。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。就培养基中营养物质的来源可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。按培养基特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。按培养基制成后的物理状态可分为固体培养基，液体培养基和半固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %-2.0 %琼脂作凝固剂; 半固体培养基则加入0.5 %-0.8 %的琼脂。       一般培养基除含有大量水分外, 还含有碳素、氮素、无机盐类和维生素等。此外, 由于徽生物生长繁殖必须在**适的酸碱度范围内, 才能表现出**大的生命活力, 因此应根据不同种类的徽生物. 将培养基调节到一定的pH值范围。   培养基配制后还必须进行灭菌, 灭菌是指杀死或消灭所有微生物, 包括营养体、孢子和芽孢。灭菌的方法很多，可分为物理方法与化学方法两大类。物理方法包括湿热灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等; 化学方法主要是利用化学药品对接种室空间、用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。消毒一般是指消灭有害微生物的营养体和病原菌。     ((((一一一一) ) ) ) 培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法培养基的配制方法         一般培养基的配制方法如下 (各种天然培养基的配制方法略有不同)：    l. 按照配方的组分及用量先分别称量并配成液体； 2. 根据要求调到一定的酸碱度(pH值)； 3. 若要制成固体则加入2%琼脂并加热融化； 4. 根据需要的数量分装入试管或三角瓶中, 加上棉塞或盖上纱布；    5. 包扎好灭菌后备用。 配制斜面培养基的一般操作步骤为：称量 → 溶解 → 调pH值 → 加琼脂 → 过滤 → 分装 → 加棉塞 → 包扎 → 灭菌 → 摆斜面 → 无菌检查。 (图9-7)      ((((二二二二) ) ) ) 培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌培养基及常用器皿的灭菌   培养微生物常用的玻璃器具主要有试管、三角瓶、培养皿、吸管等, 在使用前必须先进行灭菌, 使容器中不含任何杂菌；培养微生物用的营养基质(培养基), 在接入纯种前也必须先行灭菌, 使培养基呈无菌状态。培养基可分装入器皿中一起灭菌, 也可在单独灭菌后以无菌操作分装入无菌的器皿中。    1. 棉塞制作与器皿包扎为了避免玻璃器皿在灭菌后再受空气中杂菌的污染, 仍然能保持无菌状态, 在灭菌前需进行严格的包装或包扎。试管和三角瓶常采用合适的棉花塞封口 (也可采用金属、塑料及硅胶帽套), 棉塞起过滤作用，只能让空气透过, 而空气中的微生物则不能通过。制作棉塞应采用普通未脱脂的棉花（医用脱脂棉会吸水，不宜采用）, 其制作方法有几种，可自行灵活掌握。制好的棉塞要求紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙； 总长度约为管口直径的2倍， 插入部分约为2/3, 松紧度合适；外露部分的粗细及结实程度，应合乎一定要求。       若因棉花纤维过短，可在棉塞外面包上1层纱布，便于无菌操作，减少棉塞的污染机率，并可延长棉塞使用时间。新做的棉塞弹性较大，不易定形, 但插在容器上经过一次高压蒸汽灭菌后，形状大小即可固定。三角瓶也可用8～12层纱布代替棉塞, 通气效果更佳。       蒸汽灭菌前, 一般将7-10支试管用绳扎在一起，用牛皮纸包裹棉花塞部分，再用绳扎紧；每个三角瓶可单独用牛皮纸包扎棉花塞部分, 防止水蒸汽弄湿。 培养皿是专为防止空气中杂菌的污染而设计的, 底皿加上皿盖为一套。洗净烘干后通常每10套叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，外面用绳子捆扎以防散开，然后进行灭菌。到使用时，才在超净工作台中取出打开。        洗净烘干的吸管，在吸气的一端用镊子或针塞入少许未脱脂棉花(棉花勿外露)，以防止菌体误吸入洗耳球中，或洗耳球中的微生物通过吸管而进入培养物中造成污染。每支吸管用一条宽约5 cm的纸条，以约45度角螺旋形卷起来，剩余一端折叠打结。灭菌后烘干，使用时才在超净工作台中从纸条抽出。    2. 培养基与器皿的高压蒸汽灭菌       一般培养基、无菌水、耐热药物及玻璃器皿等常采用高压蒸汽灭菌法。该法的优点是时间短, 灭菌效果好。它可以杀灭所有的微生物, 包括**耐热的细菌芽孢及其它休眠体。       一般培养基常用0.1MPa (1 kg/cm2或15 Ib/in2 ), 约120℃维持15-20分钟, 便可达到彻底灭菌的目的；单独玻璃器皿灭菌的温度可高些, 维持的时间可长些。灭菌的温度及维持的时间, 应随灭菌物品的性质和容量多少而灵活掌握。要注意灭菌的因素是高温而不是高压, 故灭菌锅内的冷空气要彻底排除 (在排除冷空气的条件下, 蒸汽压与温度之间有一定关系)，否则, 压力虽达到0.1Mpa (l kg/cm2 ), 但温度并没有达到要求。       实验室常用的有自控或非自控卧式高压蒸汽灭菌锅 (大量灭菌物品时使用), 也有手提式小型灭菌锅 (见图3-12)。 3. 玻璃器皿的干热灭菌         常用玻璃器皿(培养皿、三角烧瓶、试管、吸管等)、金属器皿及其它干燥耐热物品, 烘干后经适当包扎(勿装液体), 可采用干热灭菌法。干热灭菌一般在电烘箱内利用干热空气灭菌。   该法比湿热灭菌法所需的温度要高些 (160-170℃), 时间也要长些 (1-2 h)。但灭菌温度若超过180℃, 包扎器皿的纸或棉塞就容易烧焦。     二二二二、、、、无菌操作技术无菌操作技术无菌操作技术无菌操作技术       微生物无处不在, 无孔不入, 因此, 在对微生物的研究和应用过程中, 必须随时注意保持微生物纯培养物的纯洁性, 防止乃**杀灭其他微生物(杂菌)的混入；在进行分离、转接及培养微生物纯培养物时, 要采用严格的无菌操作技术, 防止被其他微生物所污染。       在微生物学研究中, 常需用接种环把微生物纯培养物, 由一个器皿移接到另一个培养容器中进行培养。由于周围环境(主要是空气)中, 存在着大量肉眼无法发现的各种微生物, 只要一打开器皿，就可能会引起器皿内的培养基或培养物, 被环境中其他微生物所污染。此外，实验室人员与所试验的微生物，应保证没有或**少直接接触或气雾接触。      因此, 微生物菌种移接的所有操作, 均应在无菌环境下进行严格的无菌操作。    ((((一一一一) ) ) ) 无菌环境条件无菌环境条件无菌环境条件无菌环境条件     无菌环境是指在无菌室、无菌箱、超净工作室或超净工作台等无菌或相对无菌的环境条件下进行操作。     超净工作室或超净工作台目前较常用, 它是用通入经超细过滤的无菌空气, 以维持其无菌状态的；而无菌室或无菌箱目前较少用, 它是在使用前一段时间内, 用紫外线灯或化学药剂进行室内空气灭菌, 以维持其相对无菌状态的。     紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。紫外线穿透力不强, 所以只适用于无菌室、接种箱和手术室内的空气及物体表面的灭菌。    ((((二二二二) ) ) ) 无菌操作接种技术无菌操作接种技术无菌操作接种技术无菌操作接种技术     上述的无菌环境条件只是相对而言, 实际上不可能保持环境的**无菌。因此接种时, 关键是要严格进行正确的无菌操作, 其要点是要充分利用酒精灯焰周围的高温区(无菌区), 即接种时, 管口和瓶口始终保持在火焰 (如酒精灯焰)旁边, 进行熟练的移接种操作, 以便保证微生物的纯种培养。     此外，挑取和移接微生物纯培养物用的接种环及接种针, 应采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备, 使用时用火焰灼烧灭菌；转移液体纯培养物时, 应采用无菌吸管或无菌移液枪。     接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染, 因此, 除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外, 熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。常用的无菌接种操作包括斜面接种、穿刺接种和液体培养接种等。穿刺接种操作#p#分页标题#e#