培养基的制备与灭菌

一、目的要求 
1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培养基的配置原则和方法。 
3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 二、基本原理 
    牛肉膏蛋白胨培养基: 
是一种应用**广泛和**普通的细菌基础培养基,有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的**基本的营养物质,所以可供细菌生长繁殖之用。    高压蒸汽灭菌: 
主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽,关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出,压力增大,沸点升高,获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性,而达到灭菌的目的。 
三、实验材料 
1. 药品:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 
2. 仪器及玻璃器皿:天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三
角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 
3. 其他物品:药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 
(一)玻璃器皿的洗涤和包装 1.玻璃器皿的洗涤 
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中.用毛刷刷洗,然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡,再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 
2.灭菌前玻璃器皿的包装 
(1) 培养皿的包扎:培养皿由一盖一底组成一套,可用报纸将几套培养皿包
成一包,或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内,加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。 
(2) 移液管的包扎:在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉),它的作
用是避免外界及口中杂菌进入管内,并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右,棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时.可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜,吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条,然后将已塞好棉花的移液管**放在长条报纸的一端,约成45℃角,折叠纸条包住**,用左手握住移液管身,有手将移液管压紧.在桌面上向前搓转,以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条,折叠打结,准备灭菌。 (二)液体及固体培养基的配制过程 1.液体培养基配制 
     (1)称量(假定配制1000ml培养基) 
按培养基配方比例依次准确地称取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入烧杯(或1000ml刻度搪瓷杯)中.牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯。 
(2)溶化 
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量(如约700ml),用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解,将药品完全溶解后,补充水到所需的总体积(1000ml);如果配制固体培养基时,将称好的琼脂放人已溶的药品中,再加热溶化,**后补足所损失的水分。 
(3)调pH 
    调pH:一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸,然后用镊子夹取此段pH试纸,在培养基中蘸一下,观看其pH范围,如培养基偏酸或偏碱时,可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时,应逐滴加入NaOH或HCI溶液,防止局部过酸或过碱,破坏培养基中成分。边加边搅拌,并不时用pH试纸测试,直**pH达7.4-7.6。反之,用1mol/LHCl进行调节。 
2.固体培养基的配制 
    配制固体培养基时,应将已配好的液体培养基加热煮沸,再将称好的琼脂(1.5~2%)加 
入,并用玻棒不断搅拌,以免糊底烧焦。继续加热**琼脂全部融化,**后补足因蒸发而失去水分。 (三)培养基的分装 
    根据不同需要,可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内,分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口,造成污染。如操作不小心,培养基沾污管口或瓶口时,可用镊子夹一小块脱脂棉,擦去管口或瓶口的培养基,并将脱脂棉弃去。 1.试管的分装 
取一个玻璃漏斗,装在铁架上,漏斗下连一根橡皮管,橡皮管下端再与另一玻璃管相接,橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时,用左手拿住空试管中部,并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内,以右手拇指及食指开放弹簧夹,中指及无名指夹佐玻璃管嘴,使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定,若所用试管大小为15×150 mm时,液体培养基可分装**试管高度1/4左有为宜;如分装固体或半固体培养基时,在琼脂完全融化后,应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5(约3—4mI),半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。 2.三角瓶的分装 
   用于振荡培养微生物时,可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液体培养基;若用于制作